Nació en Toscana, y en el año 523 fue elegido Sumo Pontífice. En Italia gobernaba el rey Teodorico que apoyaba la herejía de los arrianos. Asimismo, el emperador Justino de Constantinopla decretó cerrar todos los templos de los arrianos de esa ciudad y prohibió que los que pertenecían a la herejía arriana ocuparan empleos públicos. El rey Teodorico obligó entonces al Papa a que fuera a Constantinopla a convencer al emperador de derogar las últimas leyes, pero el Papa Juan I se negó rotundamente.
El Sumo Pontífice realizó una visita pastoral a Constantinolpla donde fue recibido por más de 15,000 fieles con velas encendidas en las manos, y estandartes. El Papa presidió solemnemente las fiestas de Navidad, y luego exhortó a los feligreses a mantenerse firmes en la fe, evitando caer en las herejías. Paralelamente, el emperador Justino se mantuvo firme en su decisión, lo cual enfureció al rey italiano quien mandó a llamar al Papa Juan y lo encerró en un oscuro calabozo. Los constantes maltratos y suplicios sufridos por el santo Papa en la cárcel, junto con otros mártires más, provocó su muerte a los pocos meses de haber sido tomado prisionero.
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